항생물질의 미생물학적 역가시험법

항생물질의 미생물학적 역가시험법은 의약품 중 항생물질의 역가를 미생물학적 방법으로 측정하는 시험법이다. 따로 규정이 없는 한 시험은 다음 방법에 따른다.

의약품각조의 정량법에 있어서 원통평판법은 가), 표준곡선법은 나), 비탁법은 다), 각각의 방법과 의약품각조의 규정에 따른다. 이 시험에 쓰는 정제수, 시약, 시액 및 계량기, 용기 등의 필요한 것은 무균인 것을 쓴다.

가) 원통평판법 (1) 원통 바깥지름 7.9 ~ 8.1 mm, 안지름 5.9 ~ 6.1 mm, 높이 9.9 ~ 10.1 mm의 스테인레스강제 원통으로서 시험에 지장을 주지 않는 것을 쓴다.

(2) 배지 따로 규정이 없는 한 다음 조성의 배지를 쓴다. 다만, 배지 성분으로서 펩톤으로 기재되어 있는 경우는 육제 펩톤 또는 카제인의 판크레아틴소화물 중 어느 것을 써도 좋다. 배지의 pH 조절은 1 mol/L 수산화나트륨시액 또는 1 mol/L 염산시액을 써서 멸균 후 pH가 규정대로 되게 한다. 멸균은 고압증기멸균기를 써서 121 ℃에서 20 분간 한다. 다만, Bacillus subtilis ATCC 6633인 경우의 배지는 암모니아시액 또는 수산화칼륨시액 또는 1 mol/L 염산시액을 써서 pH를 조절한다.

원통한천평판의 조제 따로 규정이 없는 한 안지름 90 mm 페트리접시인 경우에는 기층용 한천배지 20 mL, 안지름 약 100 mm 페트리접시인 경우에는 기층용한천배지 21 mL를 넣어 한천을 평평하게 펴서 평판을 만든다. 이 평판은 만든 날로 쓴다. 의약품각조 또는 (4)의 각각에서 규정한 시험용균액 또는 시험포자액 4.0 mL 씩을 각 평판 위에 분주하고 평판의 표면에 평평하게 펴고 실온에서 냉각시킨다. 원통 4 개를 평판 위에 안지름 약 90 mm 페트리접시인 경우에는 반지름 약 25 mm, 안지름 약 100 mm 페트리접시인 경우에는 반지름 약 28 mm의 동심원선상에 떨어뜨려 중심에 대하여 간격이 약 90°가 되도록 놓는다. 평판 위에 원통을 놓을 때에는 원통을 10 ~ 13 mm의 높이에서 수직이 되게 떨어뜨린다.

(6) 표준액 의약품각조에서 규정하는 표준품의 용액을 쓴다. 이하 고농도 표준액을 SH, 저농도 표준액을 SL로 한다.

(7) 검액 의약품각조에서 규정한다. 이하 고농도 검액을 UH, 저농도 검액을 UL로 한다. 의약품각조에서 규정하는 검액 농도는 그 농도가 명확히 기재되어 있는 한 기재량의 ± 5 % 범위에서 조제할 수 있다.

(8) 조작법 따로 규정이 없는 한 원통한천평판 5 개를 1 군으로 한다. 각 원통한천평판의 제 1 원통에는 SH, 제 2 원통에는 SL을 넣는다. 각 원통한천평판의 나머지 원통 2 개에는 UH, UL을 각각 넣는다. 32 ~ 37 ℃에서 16 ~ 20 시간 배양한다. 배양 후 각각의 억제환 지름 (mm)을 0.5 mm 이하까지 정확히 측정한다.

(9) 역가계산 원통 내의 액체의 역가(P)와 억제환의 지름(d)과의 사이에는 다음의 관계식이 성립된다.

 

(다만, α와 β는 정수)

 

필요에 따라서 이 관계식을 가지고 채취한 검체 중의 역가를 다음의 식에 따라 계산한다.

채취한 검체의 역가 = A × 고농도 표준액 1 mL 중의 역가 × 고농도 검액의 희석배율

 

 

 

 

 

 

SH, SL, UH 및 UL의 각 원통평판에서의 억제환 지름(mm)의 합을 각각 ∑SH, ∑SL, ∑UH 및 ∑UL로 한다.

나) 표준곡선법 따로 규정이 없는 한 원통, 배지, 시험용균 및 시험용균액 또는 시험포자액의 조제는 가)원통평판법의 각각에 따른다. 또 의약품각조에서 배지 등을 따로 규정하였을 경우에는 그 규정에 따른다.

(1) 원통한천평판의 조제 가)(5)의 원통한천평판의 조제에 따른다. 다만, 안지름 약 100 mm 페트리접시를 쓰고 원통 6 개를 반지름 약 28 mm의 동심원선상에 떨어뜨려 중심에 대하여 약 60°간격이 되도록 놓는다.

(2) 표준액 의약품각조에서 규정하는 표준액을 쓴다.

(3) 검액 의약품각조에서 규정한다. 의약품각조에서 규정하는 검액 농도는 그 농도가 명확히 기재되어 있는 한 기재량의 ± 5 % 범위에서 조제할 수 있다.

(4) 조작법 의약품각조에서 규정하는 각 농도의 표준액 및 표준중간희석액을 써서 다음과 같이 표준곡선을 만든다. 각 농도의 표준액에 대하여 각각 원통한천평판 3 개를 쓴다. 원통한천평판 3 개를 1 군으로 하여 각 원통한천평판위에 원통 6 개를 놓고 1 개 간격으로 원통 3 개에 각각 표준중간희석액을 넣은 다음 다른 원통 3 개에 같은 농도의 표준액을 넣는다. 이 조작을 각 농도의 표준액마다 한다. 동시에 따로 원통한천평판 3 개를 가지고 각 평판 위에 원통 6 개를 놓고 1 개 간격으로 원통 3 개에 각각 표준중간희석액을 넣고 다른 원통 3 개에 검액을 넣는다. 각 원통한천평판을 32 ~ 37 ℃에서 16 ~ 20 시간 배양하고 각 억제환의 지름을 0.5 mm 이하까지 정확히 측정한다.

(5) 역가계산 각 농도의 표준액 각 군의 원통한천평판 3 개 중의 표준중간희석액에 대한 억제환의 지름 평균값을 구하고 각 농도의 표준액에 대한 억제환의 지름 평균값 및 모든 군의 표준중간희석액에 대한 억제환의 지름 평균값(이하 보정용 평균값이라 한다)을 구한다. 보정용 평균값은 수정에 사용된다. 각 군의 표준중간희석액의 평균값이 보정용 평균값과 다를 때는 그 차를 각 군의 표준액의 평균값에 가감하여 수정한다. 예를 들어 어느 희석농도의 군에 있어서 표준액의 평균값이 19.0 mm이고 그 군의 표준중간희석액의 평균값이 19.8 mm이며 보정용 평균값이 20.0 mm이라고 하면 이것을 19.0 mm + (20.0 - 19.8 mm)로 수정한다. 이 수정 값을 가지고 역가의 대수와 억제환의 지름과의 관계를 나타내는 표준곡선을 반대수방안지에 그린다. 다음에 검액에 대한 억제환의 지름 평균값과 이에 해당하는 표준중간희석액에 대한 억제환의 지름 평균값을 구한다. 검액에 대한 억제환의 지름 평균값이 표준중간희석액의 평균값보다 클 경우에는 그 차를 표준곡선 상의 중심농도를 나타내는 억제환의 지름에 더하고 적을 경우에는 그 차를 감하여 보정한다. 그 지름에 대한 표준곡선상의 점에서 검액의 mL 당의 역가를 구한다. 여기에서 얻은 역가 값에 검액의 희석배수를 곱하여 채취한 검체의 역가를 구한다. 다만, 등비적 5 단계 농도의 표준액을 쓸 경우에는 다음 식에 따라 표준 곡선을 작성한다.

 

 

 

 

L : 표준곡선의 최저농도에 대한 억제환 지름의 계산값

H : 표준곡선의 최고농도에 대한 억제환 지름의 계산값

c : 보정용평균값

a : 최저농도 표준액에 대한 억제환 지름의 수정한 평균값,

b, d, e : 순서대로 보다 고농도의 각 표준액에 대한 각각의 억제환 지름의 수정한 평균값.

 

L점과 H점을 반대수방안지에 나타내고 직선으로 연결한다.

 

출저- 대한약전 일반시험법

 

 

예시 동영상

 

https://www.youtube.com/watch?v=oJ-vriuqtz0